MMP-2&MMP-9明膠酶譜法檢測試劑盒使用說明介紹

1. 簡介：

基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinase ，MMP) 屬于金屬蛋白酶家族，該家族由至少 20 個成員組成，并且已知參與細胞外基質蛋白的代謝。它們以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與胚胎發育、形態發生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。MMP 可通過酶譜法廣泛檢測。MMP2 & MMP9  Gelatin-Zymography Kit提供了一個簡單的酶譜電泳系統，用于檢測血液、體液、分泌物、細胞裂解液、細胞培養基等樣品中的MMP2,MMP9酶譜及活性。

2. 檢測原理：

本試劑盒采用凝膠反相酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性及其無活性前體酶原譜系。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳時SDS與樣本中的MMP可逆性結合，導致MMP氫鍵和疏水鍵破壞而不能發揮分解明膠的作用。電泳結束后取出凝膠與酶反應Buffer孵育，MMP恢復活性，凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行25-50次標準小膠檢測（如果樣本MMP含量高，孵育時間短，不用換液可最多50次），如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可最多檢測500~750個樣品。

3. 檢測目的:

本試劑盒用于檢測組織、細胞中MMP-2、MMP-9 酶譜活性及其前體酶原酶譜。

4.  試劑盒組成與儲存：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml, ?20 oC保存；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC保存；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC保存, 使用時用蒸餾水稀釋；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC保存, 使用時用蒸餾水稀釋；

E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液,50ml, 4 oC保存。

5.檢測步驟：

5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS-PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 oC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker 即可。

陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。陽性對照也可使用用戶熟悉易得的組織細胞樣品來制備。 

注：因為全血成分復雜,MMP活性較低，最好是將全血中白蛋白進行分離做陽性對照

5.3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20mAl。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

5.4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠36小時，中間18小時換液一次。如MMP活性低，Buffer A 孵育時間可延長至48小時，中間24小時換液一次。

5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37oC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37oC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應延長孵育時間為10小時或過夜。

5.6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區域。透明區域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。    

MMP透明條帶的大小、位置和酶譜的圖例。注意因為樣品未還原和加熱變性，條帶位置并不對應推算的蛋白分子量。下圖1，正常血漿樣品陽性對照可能出現的反相顯示的透明條帶位置：66kDa(MMP-2)，72kDa(proMMP-2)，87kDa(MMP-9)，92kDa(proMMP-9)，注意血漿中只有很少量的激活狀態的66kDa的MMP2，增加上樣量在ProMMP2下面隱約可見(最右側泳道)。

如下圖2，不同于正常血漿MMP酶譜，每種組織樣品(如牙周膜韌帶組織)都具有自己特定的MMP活性酶譜，部分proMMP9(92kDa)可能會結合一個25kDa微球蛋白形成MMP9復合物，條帶位置約125-130kDa，其二聚體條帶大約在215-225kDa位置(圖中并未顯現)，多聚體條帶位置240kDa，嚴格說他們都是MMP9復合體，但也有人稱其為proMMP-9。注意在這種組織中activeMMP9活性低，但activeMMP2活性高，與血漿MMP活性酶譜形成了鮮明的對比

5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中最常見的格式。

6.說明：

1. 10 mM EDTA能夠完-全抑制MMP活性。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠，作為永-久記錄保留。

3. 本試劑盒僅供科研實驗使用，不得用于食用、臨床醫療等其它用途。

4.實驗操作中，請穿戴好實驗服、防護口罩和一次性實驗手套，避免直接接觸。嚴禁入口。