明膠酶譜法MMP2/MMP9檢測(cè)試劑盒注意事項(xiàng)

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1 和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后 取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景， 但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能 同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué) 反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑 盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。

注意事項(xiàng)：

1.制備聚丙烯酰胺時(shí)應(yīng)注意排除氣泡。

2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH好在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)有絮狀物，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因?yàn)闀?huì)改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6、細(xì)胞樣本用PBS 5倍體積震蕩裂解,估算細(xì)胞的體積，然后加入5倍體積的PBS，渦旋振蕩15-30s,而后靜置或低速離心.或者手動(dòng)震蕩。

7、組織或者細(xì)胞的話可以用PBS，可以用低滲溶液如三分之一或者四分之一的生理鹽水按照5倍體積加入后震蕩裂解細(xì)胞，離心即可，步驟和提蛋白很相似即可,其實(shí)重點(diǎn)的步驟主要是采用低滲裂解液進(jìn)行裂解，組織的話可以勻漿20-30次，然后10000轉(zhuǎn)左右離心，5分鐘取上清即可

關(guān)于40左右出現(xiàn)的條帶，確實(shí)是我們好多客戶實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都會(huì)出現(xiàn)的，像什么Hela細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。還是之前給您解釋的，這個(gè)和細(xì)胞類型及明膠酶家族種類是有關(guān)系的；另外由于明膠酶譜的蛋白樣品是不*變性的，因?yàn)椴](méi)有煮沸的過(guò)程，所以可能由于變性不充分的原因?qū)е缕浞肿恿坎课徊煌Ｎ覀円灿泻枚嗫蛻糇鰴z測(cè)的時(shí)候會(huì)制備一個(gè)上樣的濃度梯度，下面給您附一個(gè)近一個(gè)客戶一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。他的在40左右也是出了條帶的。