苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF洗脫方法

苯甲脒類物質(zhì)是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑，所以將這類物質(zhì)偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠4FF上，可以從各種來源的樣品中一步純化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽釋放酶、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。

苯甲脒-瓊脂糖凝膠 4FF 對于不同的樣品的親和力不同，吸附載量取決于流速、pH、緩沖液組成和溫度等參數(shù)。

（1）讓所有的材料和試劑達(dá)到室溫。配制初始緩沖液（平衡液）和洗脫緩沖液。

（2）根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠，用去離子水清洗掉 20%乙醇，用初始緩沖液（按凝膠：緩沖液=3：1 的比例）配成勻漿。

（3）將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤濕并保持一小段液位，務(wù)必使底端無氣泡。

（4）用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi)，注意勿使產(chǎn)生氣泡。打開柱子出液口，使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，連結(jié)好柱子頂端柱頭。

（5）打開蠕動泵，讓緩沖液用使用時流速的 1.33 倍的流速流過，使柱床穩(wěn)定（注意壓力不要超過填

樣品應(yīng)*溶解，并且pH值應(yīng)與結(jié)合緩沖液pH值相同。

為了避免堵塞層析柱，我們建議通過0.45μ m過濾器進(jìn)行離心和過濾，以去除細(xì)胞碎片或其他顆粒物質(zhì)。

平衡色譜柱

用5-10個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡該柱，直到流出液電導(dǎo)和pH不變。 參考結(jié)合緩沖液：0.05M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.4。

上樣

（1）樣品用平衡液配制，樣品一定要離心或過濾后上樣。鹽濃度太大的樣品需要處理后再配。

（2）一般情況是讓目標(biāo)產(chǎn)品結(jié)合在柱子上，用平衡液洗去雜質(zhì)和沒有結(jié)合的蛋白，再選擇一種洗脫洗下目標(biāo)產(chǎn)品

洗脫

洗脫條件因樣品而異，具體參考文獻(xiàn)。

參考洗脫緩沖液：0.05M甘氨酸，pH 3.0或10mM HCl，0.5M NaCl，pH2.0，可以往收集到的洗脫液中加入pH9 1M Tris-HCl，這將防止洗脫蛋白質(zhì)由于pH低而變性。

結(jié)合物可以特異性或非特異性地洗脫。在結(jié)合緩沖液中加入20mM對氨基苯甲脒，使用競爭劑為目標(biāo)分子，抑制劑對氨基苯甲脒來洗脫特異性結(jié)合的物質(zhì)。

再生

根據(jù)樣品的性質(zhì)，可以通過用2-3床體積的高pH（0.1M Tris-HCl + 0.5M NaCl，pH8.5）和低pH值（0.1M 乙酸鈉+ 0.5M NaCl，pH 4.5）緩沖液交替洗滌填料，來再生苯甲脒-瓊脂糖凝膠 6B，該循環(huán)應(yīng)重復(fù)3次，然后用5-10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液重新平衡。