標準菌株日常管理新概念

1.1標準菌株概念 
GB/T 27405-2008 實驗室質量控制規(guī)范食品微生物檢測： 
1、標準培養(yǎng)物：標準菌株、標準儲備菌株和工作菌株的統(tǒng)稱。 
2、標準菌株：至少定義至屬或種水平的菌株。按其特征進行分類和描述，有明確的來源。 
3、標準儲備菌株：標準菌株經過一代轉接后獲得的同種菌株。 
4、工作菌株：由標準儲備轉接后獲得的同種菌株。 
1.2標準菌株的應用： 各種標準、國家標準、行業(yè)標準及企業(yè)標準等的相關微生物檢測，用于驗收培養(yǎng)基(包括試劑盒)、驗證方法和評估實驗操作。 
2.1菌株的采集： 實驗室用菌種一是到國家法定機構采購，二是購買ATCC菌種，三是科研中菌種交流。不管是哪種來源，均統(tǒng)一采集。采集中嚴格按照規(guī)范執(zhí)行。要求包裝可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保證菌種合格和環(huán)境安全。采集中要有菌種傳代標識。選擇有資質的標準菌株的合格供應商，每批標準菌株必須附帶有供應商的合格證或檢測報告或說明書，來證明所采購的標準菌株是合格的。 
2.2標準菌株和驗收： 實驗室收到標準菌株，首先應進行符合性感官檢查，記錄菌株號和標準菌株來源途徑信息，確保溯源性清楚。
同時還應記錄標準菌株名稱和數量、生物試劑日期、接收日期和有無破損等情況。 
2.3凍干標準菌株的復活： 
2.3.1開啟產品包裝：先用70%酒精棉擦拭外包裝，從凹口處撕開產品外包裝，撕掉標簽上的拉片，將其貼于菌株接收、保存記錄序號前面。 
2.3.2復活：選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（根據生物試劑商說明或有關技術通則見附錄）進行復活。菌種的活化一般是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，除非特殊情況或特別，一般不用液體培養(yǎng)基。凍干菌株的傳代次數不得超過5代，從標準菌株保藏中心購買的凍干標準菌株為第F0代。
捏管帽處安瓿瓶（僅一次）使其釋放水合液體。垂直握住安瓿瓶并輕拍之，使液體流入含小球的管底。通過擠捏壓碎小球使其與液體混合，立即將拭子浸于水合液體。擠壓并旋轉拭子，接種于初級培養(yǎng)平板，接種圈的直徑約為25mm，用一無菌接種環(huán)在先前接種區(qū)域劃線10-20次，促使分離出單菌落。同時吸出部分菌液接種胰蛋白胨大豆肉湯管，副溶血性弧菌接種3%氯化鈉菌胰蛋白胨大豆肉湯管。將接種好的平板和管立即進行培養(yǎng)。細菌培養(yǎng)溫度通常為25℃或37℃。多數凍干菌株會在幾天后長出，但是少數菌會表現出延滯期延長的現象，需要將正常培養(yǎng)時間加倍。復活后的菌株為F1代。 
2.3.3：將TSB生長的濃菌液吸0.5mL于菌株保藏管充分混勻后將液體吸出，將保藏管-18℃保存1-3年為標準儲備菌株F2代。將平板上生長的良好菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面（副溶血性弧菌用3%氯化鈉營養(yǎng)瓊脂）36℃培養(yǎng)24h當作工作菌株，記錄為F3代。 
2.4工作菌株確認方法及依據： 用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物，在相應的培養(yǎng)基平板（營養(yǎng)瓊脂、大豆胰蛋白胨瓊脂）上或相應的細菌鑒別平板（如伊紅美藍、麥康凱、BP等上劃線分離單個菌落，置適宜條件下培養(yǎng)（若該類微生物為厭氧菌，則培養(yǎng)條件應為厭氧條件）以同樣方法取真菌和酵母菌至SDA（薩布羅培養(yǎng)基）平板上或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基平板上，23～28℃下培養(yǎng)7d；培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落狀態(tài)，然后挑取單一純菌落，進行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特征及菌體形態(tài)以確定菌種。 
2.5 污染處理： 假如在該平板上發(fā)現有其他菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純。要將該污染培養(yǎng)物做滅菌處理，尋找原因，重新分離挑選純菌落。 
2.6菌種保存： 所有菌種均由實驗室專人(雙人雙鎖)保存于冰箱或其它保存方式。
要建立菌種登記臺帳，詳細記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況；每一種菌種一定要有檢測鑒定報告（具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法）；
具體菌種保存方法一般為： 將復蘇后肉湯與滅菌甘油按15%甘油比例（肉湯8.5mL+甘油1.5mL）混合，-30 ℃凍存，（可用2mL凍存管凍存多管），作為保藏儲備菌株F1代，也可使用商品化的菌種保存管。 
2.7菌種的傳代： 
2.7.1標準菌株的復蘇： 
① 菌種操作應在無菌條件下進行，防止雜菌污染。 
② 每次使用和復蘇時只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養(yǎng)。 
2.7.2標準儲備菌株每轉接一次須進行確認。（確認方法一般為他們各自*的形態(tài)，在鑒別培養(yǎng)基上的形態(tài)） 
2.8 菌種的保藏： 
2.8.1將試管內菌種放入冰箱中2～8℃冷藏保存。 
2.8.2將傳代并經過培養(yǎng)后的菌種放入冰箱中2～8℃保存。 
每支保存菌種需標明菌名、標準編號、傳次、傳代日期。 
2.9菌種的銷毀： 
2.9.1菌種使用后或超過貯存期的應進行銷毀。 
2.9.2需銷毀的菌種，應用高壓蒸汽（121℃）滅菌30分鐘。 
2.9.3滅菌后，再進行清洗和處理。 
2.9.4銷毀的菌種應做好記錄。銷毀時由化驗負責人監(jiān)督銷毀，保管人員負責銷毀。